Minimalizacja adsorpcji białek i kwasów nukleinowych

Minimalizacja adsorpcji białek i kwasów nukleinowych wymaga odpowiedniego doboru probówek, końcówek do pipet i pozostałych materiałów mających kontakt z próbką. Szczególne znaczenie ma to podczas pracy z małymi objętościami, niskimi stężeniami analitu oraz materiałem, którego nie można łatwo ponownie pozyskać.

Straty próbki nie zawsze są widoczne gołym okiem. Część białka, DNA lub RNA może pozostać na ściankach probówki, końcówki albo płytki, przez co do dalszej analizy trafia mniejsza ilość materiału, niż wynikałoby to z przygotowanego stężenia.

Czym jest adsorpcja białek i kwasów nukleinowych?

Aby skutecznie ograniczać utratę próbki, trzeba rozróżnić adsorpcję, retencję cieczy i degradację materiału.

Adsorpcja polega na gromadzeniu się cząsteczek na powierzchni materiału. Białko, peptyd, DNA lub RNA nie musi przenikać do wnętrza tworzywa — wystarczy, że zwiąże się z jego powierzchnią na skutek oddziaływań hydrofobowych, elektrostatycznych lub innych oddziaływań międzycząsteczkowych.

Retencja cieczy oznacza natomiast pozostawanie filmu, kropli albo części roztworu na ściankach końcówki lub naczynia. W tym przypadku problemem nie musi być bezpośrednie wiązanie pojedynczych cząsteczek do plastiku. Część całego roztworu pozostaje po prostu w materiale eksploatacyjnym.

Degradacja oznacza rozpad materiału, na przykład na skutek aktywności DNaz, RNaz lub proteaz. Próbka może więc zostać utracona przez adsorpcję, mimo że nie została zdegradowana.

To rozróżnienie jest istotne, ponieważ materiał opisany jako DNase Free lub RNase Free nie musi automatycznie mieć właściwości Low Binding. Analogicznie powierzchnia o ograniczonym wiązaniu nie potwierdza braku nukleaz ani sterylności.

Dlaczego adsorpcja może wpłynąć na wynik analizy?

Wpływ powierzchni laboratoryjnych na wynik analizy jest największy wtedy, gdy utracona ilość stanowi znaczną część całej próbki. Utrata jednego nanograma materiału może być pomijalna w próbce zawierającej wiele mikrogramów, ale krytyczna w przypadku próbki zawierającej tylko kilka nanogramów.

Adsorpcja może prowadzić do:

obniżenia oznaczanego stężenia,
zmniejszenia wydajności odzysku,
wzrostu zmienności między powtórzeniami,
zmiany stosunku poszczególnych składników próbki,
problemów z przygotowaniem krzywych standardowych,
obniżenia czułości dalszych analiz,
nieprawidłowej interpretacji wyników ilościowych.

W badaniach nad peptydem amyloidowym wykazano, że rodzaj polipropylenu użytego do produkcji probówki może wpływać na stopień adsorpcji. Nie oznacza to jednak, że jeden materiał będzie najlepszy dla każdego białka lub każdego protokołu — zachowanie powierzchni zależy także od właściwości analitu i warunków procesu.[1]

Dlaczego białka przywierają do powierzchni laboratoryjnych?

Białka mają złożoną strukturę przestrzenną oraz fragmenty różniące się ładunkiem i hydrofobowością. Po zetknięciu z powierzchnią probówki część cząsteczki może wejść w interakcję z materiałem, co prowadzi do jej zatrzymania na ściance.

Od czego zależy adsorpcja białek do polipropylenu?

Adsorpcja białek do polipropylenu może zależeć między innymi od:

budowy i masy cząsteczkowej białka,
rozmieszczenia fragmentów hydrofobowych,
stężenia próbki,
rodzaju i składu buforu,
pH oraz siły jonowej,
obecności detergentów lub stabilizatorów,
temperatury,
czasu kontaktu,
intensywności mieszania,
stosunku powierzchni naczynia do objętości próbki,
liczby kolejnych transferów.

W badaniu dotyczącym rekombinowanej progranuliny stwierdzono znaczną adsorpcję białka do probówek polipropylenowych. Wielokrotne przenoszenie materiału między nowymi probówkami prowadziło do kumulowania się strat, a wielkość efektu zmieniała się zależnie od warunków eksperymentu.[2]

Nie należy jednak przenosić wartości procentowych z jednego badania na wszystkie białka. Wynik dotyczący określonego peptydu, enzymu lub przeciwciała nie musi odpowiadać zachowaniu innego analitu.

Czy każda probówka z polipropylenu zachowuje się tak samo?

Nie. Skrót „PP” informuje o podstawowym rodzaju tworzywa, ale nie opisuje wszystkich właściwości gotowego produktu.

Znaczenie mogą mieć między innymi:

rodzaj i czystość polipropylenu,
zastosowane dodatki technologiczne,
budowa formy produkcyjnej,
chropowatość i zwilżalność powierzchni,
sposób sterylizacji,
ewentualna modyfikacja powierzchni,
geometria probówki.

Dlatego przywieranie białek do probówek należy oceniać na poziomie konkretnego produktu, a nie wyłącznie nazwy materiału.

Co więcej, oznaczenie Low Binding nie stanowi bezwarunkowej gwarancji najlepszego wyniku dla każdego białka. W badaniu dotyczącym surfaktantowego białka D niektóre komercyjne probówki o deklarowanym ograniczonym wiązaniu nie zredukowały adsorpcji tego konkretnego analitu, mimo że w kontroli z innym białkiem zachowywały się korzystniej.[3]

Wniosek praktyczny: im bardziej wartościowa, niestabilna lub rozcieńczona jest próbka, tym większe znaczenie ma walidacja materiału w warunkach konkretnej metody.

Dlaczego DNA i RNA przywierają do ścianek probówek?

Adsorpcja DNA i RNA do plastiku laboratoryjnego jest zjawiskiem zależnym od rodzaju powierzchni, stężenia materiału, składu roztworu, czasu przechowywania i temperatury.

Kwasy nukleinowe są cząsteczkami naładowanymi. Ich oddziaływanie z powierzchnią może zmieniać się w zależności od pH, obecności soli, długości fragmentów oraz konformacji materiału.

Problem jest szczególnie istotny przy:

eluatach po izolacji DNA lub RNA,
próbkach ChIP,
cfDNA,
oligonukleotydach,
materiałach przeznaczonych do NGS,
standardach ilościowych,
próbkach o stężeniu na poziomie nanogramowym lub niższym,
niewielkich objętościach roboczych.

Utrata DNA i RNA na ściankach probówek

Utrata DNA i RNA na ściankach probówek nie musi oznaczać, że materiał został zniszczony. Część kwasu nukleinowego może pozostać związana z powierzchnią i nie być dostępna podczas pobierania próbki do kolejnego etapu.

W badaniu dotyczącym oczyszczonego DNA w zakresie nanogramowym wykazano, że ilość materiału pozostającego w roztworze zależała od:

stężenia DNA,
rodzaju probówki,
temperatury przechowywania,
czasu przechowywania.

Przy niższym stężeniu procentowa utrata materiału była większa. Jednocześnie różne probówki reklamowane jako Low Binding, Low Retention lub Maximum Recovery nie dawały identycznych wyników.[4]

To pokazuje, dlaczego DNA i RNA przywierają do ścianek probówek w stopniu, którego nie da się przewidzieć wyłącznie na podstawie ogólnej nazwy tworzywa.

Czy większa probówka jest bezpieczniejsza dla próbki?

Nie zawsze. Umieszczenie bardzo małej objętości w dużej probówce może zwiększyć stosunek powierzchni kontaktu do objętości próbki.

Dla przykładu 20 µl roztworu przechowywane w probówce 2 ml może kontaktować się z relatywnie dużą powierzchnią tworzywa. Jeżeli pozwala na to procedura, lepszym rozwiązaniem może być naczynie o mniejszej objętości nominalnej, zapewniające jednocześnie bezpieczne zamknięcie i wygodne pobieranie próbki.

Kiedy adsorpcja stanowi największe ryzyko?

Nie każda procedura wymaga specjalistycznych powierzchni niskoadhezyjnych. Ryzyko powinno być oceniane w odniesieniu do rodzaju próbki i znaczenia ewentualnej straty.

Czynnik	Dlaczego zwiększa ryzyko?	Zalecane działanie
Niskie stężenie analitu	Nawet niewielka utrata stanowi dużą część próbki	Rozważyć materiały Low Binding i wykonać test odzysku
Mała objętość	Rośnie stosunek powierzchni kontaktu do objętości	Dobrać najmniejsze praktyczne naczynie
Wiele transferów	Każda nowa końcówka i probówka to kolejna powierzchnia	Uprościć workflow i ograniczyć przepipetowywanie
Długi czas przechowywania	Wydłuża się czas kontaktu próbki z powierzchnią	Używać odpowiednich naczyń magazynowych
Materiał trudny do pozyskania	Nie można łatwo powtórzyć pobrania	Zweryfikować materiały przed właściwym badaniem
Analiza ilościowa	Strata może zmienić wynik liczbowy	Stosować identyczne materiały dla wszystkich próbek
Roztwory z detergentami	Mogą pozostawiać film w standardowych końcówkach	Rozważyć końcówki Low Retention
Próbki białkowe i peptydowe	Cząsteczki mogą oddziaływać z powierzchnią PP	Sprawdzić materiały Protein Low Binding

Szczególnej uwagi wymaga pipetowanie próbek o małej objętości, ponieważ błąd dozowania, pozostawanie cieczy w końcówce i adsorpcja do probówki mogą występować jednocześnie.

Low binding a low retention – czym różnią się powierzchnie low binding i low retention?

Pojęcia Low Binding i Low Retention są często używane zamiennie, ale opisują inne problemy.

Low Binding odnosi się przede wszystkim do ograniczenia wiązania określonych cząsteczek, takich jak białka, peptydy, DNA lub RNA, do powierzchni naczynia.
Low Retention odnosi się przede wszystkim do ograniczenia pozostawania cieczy na ściankach końcówki albo naczynia.

Porównanie oznaczeń stosowanych w materiałach laboratoryjnych

Oznaczenie	Główne znaczenie	Typowe produkty	Czego nie potwierdza automatycznie?
Protein Low Binding	Ograniczone wiązanie białek i peptydów	Probówki, płytki	Braku nukleaz, sterylności i niskiej retencji cieczy
DNA/RNA Low Binding	Ograniczone wiązanie kwasów nukleinowych	Probówki, płytki PCR	Sterylności i odporności na każdą temperaturę
Low Retention	Mniejsza ilość cieczy pozostającej na powierzchni	Głównie końcówki do pipet	Ograniczonego wiązania każdego białka lub DNA
DNase/RNase Free	Brak wykrywalnej aktywności określonych nukleaz zgodnie z deklaracją lub badaniem producenta	Końcówki, probówki, płytki PCR	Właściwości Low Binding
Sterylne	Produkt poddany zwalidowanemu procesowi sterylizacji	Różne materiały eksploatacyjne	Braku DNaz, RNaz, pirogenów lub niskiej adsorpcji
Non-Pyrogenic	Ograniczony poziom pirogenów według określonego kryterium	Produkty do pracy biologicznej	Sterylności i braku nukleaz

Czy niskoadhezyjne oznacza to samo co Low Binding?

Polskie określenie „niskoadhezyjne” bywa stosowane zarówno wobec powierzchni Low Retention, jak i Low Binding. Dlatego nie należy oceniać produktu jedynie na podstawie przetłumaczonej nazwy handlowej.

Trzeba sprawdzić:

czego dokładnie dotyczy deklaracja producenta,
dla jakiego rodzaju próbki wykonano test,
czy dostępne są dane ilościowe,
czy właściwość dotyczy probówki, końcówki czy innego naczynia,
czy produkt ma również wymagany poziom czystości biologicznej.

Najważniejsza zasada: końcówki Low Retention nie zastępują probówek Low Binding, a materiały DNase/RNase Free nie rozwiązują automatycznie problemu adsorpcji.

Więcej informacji o ochronie materiału genetycznego przed degradacją enzymatyczną znajduje się w artykule: Znaczenie certyfikacji RNase Free i DNase Free w biologii molekularnej.

Jak zmniejszyć straty próbki podczas pipetowania?

Ograniczenie strat podczas pipetowania wymaga jednoczesnego uwzględnienia rodzaju końcówki, zakresu pipety, właściwości cieczy i techniki operatora.

Jakie końcówki stosować do próbek o małej objętości?

Do pipetowania próbek o małej objętości należy wybierać końcówki:

dopasowane do zakresu pipety,
zapewniające szczelne osadzenie,
o możliwie małej objętości nominalnej,
wykonane z materiału odpowiedniego do danej cieczy,
z deklaracją Low Retention, gdy problemem jest pozostawanie filmu cieczy,
z filtrem, gdy konieczna jest ochrona przed aerozolami i kontaminacją,
DNase/RNase Free, gdy wymaga tego praca z materiałem genetycznym.

Przykładowo do dozowania niewielkich objętości można zastosować sterylne końcówki Low Retention 10 µl, wolne od DNaz i RNaz. W przypadku większego zakresu dostępne są również końcówki Low Retention 200 µl.

Kiedy niskoretencyjne końcówki do pipet są szczególnie przydatne?

Niskoretencyjne końcówki do pipet warto rozważyć podczas pracy z:

roztworami zawierającymi detergenty,
enzymami i mieszaninami reakcyjnymi,
próbkami o bardzo małej objętości,
lepkimi cieczami,
kosztownymi reagentami,
próbkami o ograniczonej dostępności,
procedurami wymagającymi wysokiej powtarzalności dozowania.

Jeżeli dodatkowo potrzebna jest ochrona pipety i kolejnych próbek przed aerozolami, można zastosować niskoadhezyjne końcówki z filtrem 1000 µl Professional Line.

Filtr nie poprawia jednak automatycznie odzysku cieczy. Jego podstawową funkcją jest ograniczenie przenoszenia aerozoli i zanieczyszczeń między próbką a trzonem pipety.

Technika pipetowania a odzysk próbki

Nawet właściwie dobrane końcówki low retention nie skompensują wszystkich błędów proceduralnych. Warto przestrzegać następujących zasad:

Używaj pipety w odpowiednim zakresie. Nie dozuj 10 µl pipetą o maksymalnej objętości 1000 µl.
Zwilż końcówkę przed właściwym pobraniem. Kilkukrotne pobranie i wydanie tej samej cieczy może ustabilizować warunki pipetowania.
Utrzymuj stałą głębokość zanurzenia. Zbyt głębokie zanurzenie zwiększa ryzyko pobrania cieczy na zewnętrzną powierzchnię końcówki.
Pipetuj płynnie. Gwałtowne zwalnianie tłoka może sprzyjać powstawaniu pęcherzy i niepełnemu pobieraniu.
Dotykaj końcówką ścianki naczynia podczas wydawania, jeżeli pozwala na to procedura.
Odczekaj krótko po pobraniu cieczy, szczególnie w przypadku próbek lepkich.
Ogranicz liczbę transferów. Każda nowa powierzchnia może powodować dodatkową stratę.
Dobierz technikę do cieczy. Pipetowanie rewersyjne może być korzystne w przypadku cieczy lepkich lub pieniących.

Odpowiadając zatem na pytanie, jak zmniejszyć straty próbki podczas pipetowania: należy traktować pipetę, końcówkę, technikę i naczynie docelowe jako jeden system.

Jak ograniczyć adsorpcję białek do plastiku laboratoryjnego?

Nie ma jednego materiału, który zawsze zapewni taki sam odzysk wszystkich białek. Dobór powinien uwzględniać właściwości analitu oraz cały proces przygotowania próbki.

Jakie materiały laboratoryjne wybrać do pracy z białkami?

Materiały do pracy z białkami warto oceniać według następujących kryteriów:

deklarowana właściwość Protein Low Binding,
wyniki testów dla białek lub peptydów,
materiał wykonania,
objętość nominalna naczynia,
geometria i powierzchnia kontaktu,
szczelność,
kompatybilność chemiczna,
zakres temperatur,
możliwość wirowania,
sposób sterylizacji,
obecność dodatków powierzchniowych.

W proteomice małych próbek zaleca się zwracanie szczególnej uwagi na materiał naczyń oraz stosunek powierzchni do objętości. W przeglądzie dotyczącym przygotowywania próbek o małej liczbie komórek wskazano, że niespecyficzne wiązanie białek i peptydów do powierzchni może być istotnym źródłem strat.[5]

Czy standardowe probówki wystarczą?

W rutynowej pracy, przy relatywnie wysokich stężeniach i krótkim czasie kontaktu, standardowa probówka polipropylenowa może być wystarczająca. Nie oznacza to jednak, że można ją opisywać jako Low Binding bez odpowiedniej deklaracji producenta.

Dostępne w ofercie Googlab probówki wirówkowe typu Eppendorf 1,5 ml z zamknięciem Safe Lock mogą być wykorzystywane do przygotowywania, wirowania i przechowywania próbek zgodnie ze specyfikacją produktu. Nie należy jednak przedstawiać ich jako probówek Protein Low Binding, jeżeli producent nie potwierdził tej właściwości.

Czy dodanie białka nośnikowego rozwiązuje problem?

W niektórych protokołach stosuje się albuminę, inne białka nośnikowe lub detergenty, aby zajęły dostępne miejsca wiązania na powierzchni. Takie rozwiązanie może być skuteczne, ale nie jest uniwersalne.

Dodatek może:

wpływać na dalszą analizę,
zmieniać aktywność badanego białka,
utrudniać analizę proteomiczną,
zwiększać tło,
nie być dopuszczony w zwalidowanej procedurze diagnostycznej.

Taką modyfikację należy stosować wyłącznie wtedy, gdy jest zgodna z protokołem i została zwalidowana.

Jak przechowywać próbki, aby ograniczyć ich adsorpcję?

Przechowywanie powinno być planowane na podstawie rodzaju materiału, jego stężenia, objętości, czasu oraz temperatury.

Jak wybierać probówki do przechowywania DNA i RNA?

Probówki do przechowywania DNA i RNA powinny być oceniane między innymi pod kątem:

deklaracji DNase/RNase Free,
właściwości DNA/RNA Low Binding, jeżeli są wymagane,
szczelności zamknięcia,
odporności na temperaturę przechowywania,
kompatybilności z zamrażaniem,
odporności na wirowanie,
objętości roboczej,
możliwości bezpiecznego pobrania próbki,
dokumentacji producenta.

Dla materiału o bardzo niskim stężeniu warto rozważyć probówki z potwierdzoną powierzchnią ograniczającą wiązanie kwasów nukleinowych. Nie należy zakładać, że każda probówka opisana jako Low Retention będzie miała takie same właściwości wobec DNA.

Praktyczne zasady przechowywania

Aby ograniczyć adsorpcję i inne źródła utraty materiału:

Dobierz objętość probówki do objętości próbki.
Przygotuj alikwoty, aby ograniczyć liczbę cykli zamrażania i rozmrażania.
Unikaj częstego przenoszenia próbki do kolejnych naczyń.
Stosuj jeden zwalidowany typ probówek dla wszystkich próbek w danym badaniu.
Nie zmieniaj producenta lub numeru katalogowego w trakcie serii bez oceny porównawczej.
Ogranicz czas przetrzymywania bardzo rozcieńczonego materiału w naczyniach roboczych.
Dokumentuj numer partii materiałów eksploatacyjnych w procesach krytycznych.
Sprawdź zgodność temperatury z kartą produktu.

Do przygotowania analiz molekularnych można wykorzystać probówki 0,2 ml do PCR i RT-qPCR typu 8-strip, deklarowane jako wolne od DNaz, RNaz i pirogenów. Oznaczenie to dotyczy czystości biologicznej produktu, a nie automatycznie jego właściwości Low Binding.

W procesach przygotowania mieszanin do PCR i RT-PCR uzupełniającym materiałem może być woda Nuclease-Free PCR-grade, wolna od DNaz, RNaz i proteaz. Woda wolna od nukleaz pomaga ograniczyć ryzyko degradacji, ale nie zmienia właściwości powierzchni probówki lub końcówki.

Jak zwiększyć odzysk białka, DNA lub RNA z próbki?

Najskuteczniejsze podejście polega na ocenie całej drogi próbki, a nie wyłącznie jednego produktu.

Krok 1. Zidentyfikuj wszystkie powierzchnie kontaktu

Przeanalizuj cały proces:

naczynie magazynowe → końcówka → probówka robocza → końcówka → płytka → fiolka pomiarowa

Uwzględnij także:

rynienki reagentowe,
mieszadła,
filtry,
membrany,
uszczelnienia,
korki,
elementy urządzeń automatycznych.

Krok 2. Określ główny mechanizm straty

Zadaj pytanie, co prawdopodobnie powoduje problem:

pozostawanie filmu cieczy,
adsorpcja białka,
adsorpcja DNA lub RNA,
degradacja enzymatyczna,
parowanie,
nieszczelność,
błąd objętościowy,
niepełne wymieszanie.

Dopiero wtedy można dobrać właściwe rozwiązanie.

Krok 3. Dopasuj właściwość produktu

Zaobserwowany problem	Właściwość, którą należy rozważyć
Ciecz pozostaje w końcówce	Low Retention
Białko znika podczas inkubacji w probówce	Protein Low Binding
Spada odzysk rozcieńczonego DNA	DNA Low Binding
Istnieje ryzyko degradacji RNA	RNase Free
Istnieje ryzyko degradacji DNA	DNase Free
Możliwe przenoszenie aerozoli	Końcówki z filtrem
Próbka będzie zamrażana	Potwierdzona odporność temperaturowa i szczelność
Problem występuje po wielu transferach	Ograniczenie liczby etapów

Krok 4. Wykonaj prosty test odzysku

Przy materiałach krytycznych warto wykonać porównanie przed zakupem dużej partii:

Przygotuj jednorodną próbkę kontrolną.
Rozdziel ją do badanych probówek.
Zachowaj identyczną objętość, temperaturę i czas kontaktu.
Użyj tej samej partii odczynników.
Oznacz materiał bezpośrednio po przygotowaniu.
Powtórz oznaczenie po określonym czasie.
Oblicz procent odzysku:

odzysk [%] = wynik po przechowywaniu ÷ wynik początkowy × 100%

Przykład:

stężenie początkowe: 10 ng/µl,
stężenie po przechowywaniu: 8,5 ng/µl.

Odzysk = 8,5 ÷ 10 × 100% = 85%

Oznacza to, że zmierzona ilość materiału dostępnego w roztworze zmniejszyła się o 15%. Sam test nie określa jeszcze, czy przyczyną była adsorpcja, degradacja czy błąd analityczny, dlatego należy zastosować odpowiednie kontrole.

Krok 5. Oceń również powtarzalność

Nie wystarczy porównanie pojedynczych probówek. Test powinien obejmować kilka powtórzeń, ponieważ istotna jest nie tylko średnia wartość odzysku, ale również zmienność wyników.

Najlepszy materiał to nie zawsze ten, który daje najwyższy pojedynczy wynik. W procedurach ilościowych równie ważna jest powtarzalność między próbkami.

Jak dobrać materiały do konkretnego zastosowania?

Poniższa tabela może służyć jako pierwszy etap kwalifikacji produktów. Ostateczny wybór powinien zostać potwierdzony dokumentacją i — w procesach krytycznych — testem wewnętrznym.

Zastosowanie	Główne ryzyko	Rekomendowany kierunek wyboru
Pipetowanie enzymów i roztworów z detergentami	Film cieczy w końcówce	Końcówki Low Retention
Praca z białkami o niskim stężeniu	Wiązanie do probówki	Probówki Protein Low Binding
Przechowywanie rozcieńczonego DNA	Adsorpcja do powierzchni	Probówki DNA Low Binding
Praca z RNA	Degradacja i adsorpcja	RNase Free oraz — jeżeli potrzeba — RNA Low Binding
PCR i RT-qPCR	Kontaminacja, nukleazy, parowanie	Materiały PCR DNase/RNase Free i szczelne zamknięcie
Małe objętości	Duży stosunek powierzchni do objętości	Małe naczynia i odpowiednie końcówki
Próbki kliniczne	Ograniczona możliwość ponownego pobrania	Zweryfikowany workflow i pełna identyfikowalność materiałów
Proteomika małych próbek	Niespecyficzne wiązanie peptydów	Materiały o niskim wiązaniu białek
Długie przechowywanie	Adsorpcja, parowanie i degradacja	Szczelne naczynie, właściwa temperatura i alikwotowanie

Najczęstsze błędy prowadzące do utraty próbki

Uznawanie każdego polipropylenu za materiał Low Binding

Polipropylen jest powszechnie stosowany w laboratoriach, ale poszczególne produkty mogą różnić się właściwościami powierzchni. Samo oznaczenie PP nie wystarcza do potwierdzenia niskiej adsorpcji.

Utożsamianie Low Retention z Low Binding

Końcówka może ograniczać pozostawanie cieczy, ale nie musi mieć potwierdzonej zdolności ograniczania wiązania konkretnego białka albo DNA.

Utożsamianie DNase/RNase Free z brakiem adsorpcji

Brak wykrywalnej aktywności nukleaz dotyczy ryzyka degradacji enzymatycznej. Nie opisuje ilości materiału, która może pozostać na powierzchni.

Stosowanie jednej wartości odzysku dla wszystkich analitów

Wynik uzyskany dla albuminy, przeciwciała lub jednego fragmentu DNA nie może być automatycznie przeniesiony na inne próbki.

Wielokrotne przenoszenie próbki

Każdy transfer zwiększa liczbę powierzchni kontaktu. Nawet umiarkowana strata na pojedynczym etapie może się kumulować.

Stosowanie zbyt dużego naczynia

Bardzo mała próbka umieszczona w dużej probówce może kontaktować się z nieproporcjonalnie dużą powierzchnią materiału.

Brak kontroli numerów partii

Zmiana materiału, producenta albo partii może wprowadzić dodatkową zmienność. W procedurach ilościowych warto dokumentować użyte materiały eksploatacyjne.

Skupianie się wyłącznie na cenie zakupu

Koszt końcówki lub probówki jest zwykle niewielki w porównaniu z kosztem próbki, pracy personelu, odczynników i powtórzenia analizy.

FAQ – adsorpcja białek, DNA i RNA

Czy każda próbka wymaga stosowania materiałów Low Binding?

Nie. Materiały Low Binding są szczególnie uzasadnione przy niskich stężeniach, małych objętościach, długim czasie kontaktu oraz pracy z materiałem o wysokiej wartości. W rutynowych analizach o większej objętości standardowe materiały mogą być wystarczające, o ile zapewniają wymaganą powtarzalność.

Czy końcówki Low Retention poprawiają dokładność pipetowania?

Mogą ograniczać ilość cieczy pozostającej na ściankach, szczególnie w przypadku niektórych roztworów zawierających detergenty, cieczy lepkich i próbek o małej objętości. Rzeczywisty efekt zależy jednak od rodzaju cieczy, pipety, końcówki i techniki operatora.

Czy sterylne probówki są jednocześnie wolne od DNaz i RNaz?

Nie zawsze. Sterylność i brak aktywności nukleaz są różnymi właściwościami. Należy zweryfikować każdą deklarację oddzielnie w specyfikacji producenta.

Czy DNase/RNase Free oznacza, że DNA i RNA nie będą przywierały do probówki?

Nie. Oznaczenie dotyczy braku wykrywalnej aktywności określonych enzymów, a nie adsorpcji kwasów nukleinowych do powierzchni.

Czy zwykłe probówki polipropylenowe nadają się do przechowywania DNA i RNA?

Mogą być wystarczające w wielu rutynowych zastosowaniach. Przy bardzo niskich stężeniach lub próbkach krytycznych warto jednak rozważyć probówki z potwierdzoną właściwością DNA/RNA Low Binding i wykonać test odzysku.

Czy białko może przywierać do probówki w ciągu kilku minut?

Tak. Szybkość adsorpcji zależy od białka, powierzchni, stężenia i warunków. W przypadku niektórych białek znaczący efekt obserwowano już po krótkim czasie kontaktu.[2]

Czy adsorpcję można całkowicie wyeliminować?

Nie można zagwarantować całkowitego wyeliminowania adsorpcji dla każdego analitu i protokołu. Można jednak ograniczać jej znaczenie poprzez właściwy dobór materiałów, skrócenie czasu kontaktu, zmniejszenie liczby transferów i walidację odzysku.

Jak rozpoznać, że problemem jest adsorpcja, a nie degradacja?

Samo obniżenie stężenia nie pozwala jednoznacznie określić mechanizmu. Potrzebne są kontrole pozwalające oddzielić adsorpcję, degradację, parowanie i błąd pomiarowy. Pomocne może być badanie materiału pozostającego na powierzchni lub porównanie wyników w różnych typach naczyń.

Podsumowanie: jak ograniczyć utratę cennego materiału?

Minimalizacja adsorpcji białek i kwasów nukleinowych nie polega na wyborze jednego produktu oznaczonego jako „niskoadhezyjny”. Konieczne jest przeanalizowanie całego procesu — od przechowywania materiału, przez pipetowanie, aż po naczynie wykorzystywane w końcowym pomiarze.

Najważniejsze zasady to:

rozróżnienie Low Binding, Low Retention i DNase/RNase Free,
dopasowanie objętości naczynia do objętości próbki,
ograniczenie liczby transferów,
skrócenie czasu kontaktu z powierzchnią,
stosowanie materiałów o właściwościach odpowiadających konkretnemu problemowi,
zachowanie jednego typu materiałów w obrębie całej serii,
przeprowadzenie testu odzysku dla próbek krytycznych.

Dobierając materiały mające bezpośredni kontakt z próbką, należy opierać się na specyfikacji producenta i rzeczywistych wymaganiach metody. W przypadku analiz białek, DNA lub RNA o niskim stężeniu nawet niewielka poprawa odzysku może przełożyć się na większą powtarzalność i mniejsze ryzyko konieczności powtarzania całego procesu.

Sprawdź dostępne w Googlab.pl końcówki Low Retention, materiały do przygotowania próbek oraz produkty przeznaczone do biologii molekularnej. Przy doborze produktu do określonej aplikacji warto uwzględnić objętość, rodzaj próbki, wymagany poziom czystości i warunki przechowywania.

Źródła

Kofanova O.A., Mommaerts K., Betsou F., „Tube Polypropylene: A Neglected Critical Parameter for Protein Adsorption During Biospecimen Storage”, Biopreservation and Biobanking, 2015.
Publikacja w bazie PubMed
Nguyen A.D. i wsp., „Progranulin Adsorbs to Polypropylene Tubes and Disrupts Functional Assays: Implications for Research, Biomarker Studies, and Therapeutics”, Frontiers in Neuroscience, 2020.
Pełny tekst w PubMed Central
Bratcher P.E., Gaggar A., „Characterization and Prevention of the Adsorption of Surfactant Protein D to Polypropylene”, PLoS ONE, 2013.
Pełny tekst w PubMed Central
Lü J. i wsp., „Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in ChIP-seq application”, BMC Genomics, 2017.
Pełny tekst w PubMed Central
Kelly R.T., „Proteomics for Low Cell Numbers: How to Optimize the Sample Preparation Workflow for Mass Spectrometry Analysis”, Journal of Proteome Research, 2021.
Pełny tekst w PubMed Central